ТРАНСГЕНФАРМ
Биотехнологический центр трансгенеза
в фарминдустрии


("ТРАНСГЕНФАРМ")
ТРАНСГЕНФАРМ

СЕРТИФИКАЦИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ЛАКТОФЕРРИНА ЧЕЛОВЕКА.

Е.Р.Садчикова



Cовременная пищевая промышленность и медицина немыслимы без использования новых высокоэффективных и биологически полноценных продуктов питания и высокоэффективных и безопасных лекарственных средств. В первую очередь, ими являются биологически активные белки человека: гормоны, ферменты, факторы свертывающей системы крови, роста тканей, иммуномодуляторы, белки женского молока и многие другие. Постоянно присутствуя в организме человека, они обеспечивают его здоровье. Беда, если вследствие наследственного или приобретенного заболевания какой-либо биологически активный белок отсутствует, или его количество снижено. В этих случаях больной человек должен получить данный белок извне. А где его взять? Можно позаимствовать у другого человека. В промышленных масштабах это невозможно, да и опасно, можно заразиться гепатитом, или хуже того, СПИДом. Тем не менее, лекарственные белки в аптеках есть. Сегодня их получают биотехнологическими методами. И это не методы выбора, а единственные, позволяющие достичь желаемого результата. Самый распространенный из них - метод микробного синтеза. Для этого в микроорганизм вставляют ген человека, т.е. делают его трансгенным. Такой микроорганизм начинает продуцировать соответствующий белок. Что же таким образом получают? Инсулин, интерфероны, гормон роста, факторы свертывающей системы крови. Можно прибавить еще с десяток производимых микробным синтезом белков человека. Эти лекарственные белки в известной степени отличаются от природных в силу того, что микроорганизмы по части синтеза белков не могут соперничать с клетками человека. Недостатком лекарственных белков человека, полученных методом микробного синтеза, является также то, что они часто вызывают у пациентов нежелательные аллергические реакции. Как правило, полученные с использованием биотехнологических методов лекарственные средства инъекционные, многие из них человек вынужден использовать на протяжении всей жизни, с момента рождения.

По оценкам Всемирной Организации Здравоохранения в мире от предотвратимых и излечиваемых болезней ежегодно умирают около 9 миллионов детей. Основной вклад в это вносят заболевания микробной и вирусной природы: респираторная инфекция верхних дыхательных путей, пневмония, диарея, малярия и ВИЧ/СПИД. Высокоэффективных и биологически безопасных форм противомикробных лекарственных средств для детей раннего возраста нет. Природа позаботилась о детях наличием в женском грудном молоке бактерицидного белка лактоферрина, который оберегает новорожденного ребенка до момента становления у него собственного механизма иммунологической защиты. Дети, находящиеся на искусственном вскармливании, оказываются беззащитными перед окружающими их инфекциями, поскольку в питательных смесях отсутствуют бактерицидные факторы. Использование донорского женского молока, как источника лактоферрина, во многих странах ограничено, а в Российской Федерации, запрещено, в связи с возможностью вирусной контаминации (СПИД, гепатит) (Приложение 5а к СанПиН 2.3.2.1078-01 "Биологически активные вещества, компоненты пищи и продукты, являющиеся их источниками, не оказывающие вредного воздействия на здоровье человека при использовании для изготовления биологически активных добавок к пище": "п.3.3. биологически активные вещества - иммунные белки и ферменты, гликопептиды, лизоцим, лактоферрин, лактопероксидаза, бактериоцины молочнокислых микроорганизмов, за исключением препаратов из тканей и жидкостей человека"). По этой же причине необходимо будет искать замену женскому молоку для тех детей, матери которых страдают инфекционной патологией, могущей передаваться с молоком.

Лактоферрин человека, полученный биотехнологическими методами, например, с обладающим противоаллергенными свойствами молоком коз будет хорошим выходом из этого положения. На первом этапе его будут использовать как пищевую добавку, а затем и как лекарственное средство. Таким образом, лактоферрин человека будет поступать в организм человека через рот. Никаких отрицательных эффектов, при соблюдении соответствующих дозировок не просматривается. Более проблематично использовать в пищу гетерогенные белки животного происхождения (мясо, колбаса).

Новейшие исследования показывают, что рост и развитие желудочно-кишечного тракта детей, вскармливаемых материнским молоком, происходит интенсивнее, чем у вскармливаемых молочными смесями. Лактоферрин человека является фактором, стимулирующим клеточный рост. Это открытие увеличивает значимость лактоферрина для грудных детей.

Во многих странах развернут широкий фронт исследований по получению рекомбинантного лактоферрина человека в микроскопических грибах (Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae), растениях (табак, картофель, рис). Делаются попытки организовать в промышленных масштабах выпуск рекомбинантного лактоферрина человека, выделенного из молока трансгенных коров.

За рекомбинантным лактоферрином человека большое будущее. Его производство будет многотоннажным, поскольку он станет обязательной биологической добавкой к промышленным молочным смесям, заменителям грудного молока. Рекомбинантный лактоферрина человека будет также использоваться как пищевая добавка, и как основа высокоэффективных и биологически безопасных лекарственного средства.

На сегодняшний день в продаже имеется лактоферрин человека полученный при помощи грибков рода Aspergillus, а также из риса.

В настоящее время на разных стадиях доклинических и клинических испытаний изучается возможность использования рекомбинантного лактоферрина человека, полученного из различных источников в качестве лекарственного средства.

Компания Agennix выполнила исследования рекомбинантного лактоферрина человека из Aspergillus awamori на 720 добровольцах. Имеются отчёты по 1-й и 2-й стадиях доклинических испытаний. Сообщается, что на предварительном этапе на 6 добровольцах была показана хорошая переносимость этого препарата, при максимальной дозе 9 г/день на человека в течение 7 дней, 5г/день на 15 здоровых добровольцах при однократном введении. Биологическая доступность препарата составила менее 0,5% (не отмечено влияние дозы на колебание концентрации лактоферрина в крови ни при однократном введении, ни при введении в течение 7 дней). На мышах определена оптимальная максимальная (исследовались дозировки до 1г/кг) клиническая доза в 9г/день (примерно 0,15г/кг для человека). На всех стадиях доклинических испытаний этот препарат в дозировке 9г/день не вызывал у пациентов практически ни каких побочных реакций или они не отличались от таковых для "плацебо".

Мы начали всесторонние испытания рекомбинантного лактоферрина человека в полном соответствии с процедурой прописанной законодательством РФ. Прежде всего, детально исследовали физико-химические свойства и биологическую активность лактоферрина человека, полученного из различных источников, в сравнении с лактоферрином женского грудного молока.

Детальному анализу подвергся лактоферрин человека выделенный нами из молока мышей и из молока продуцирующих этот белок коз. (A.B. Соколов, М.О. Пулина, А.В. Кристиян, Е.Т. Захарова, О.Л. Рунова, В.Б. Васильев, Я.Г.Гурский, М.М. Минашкин, А.Н. Краснов, С.Г. Кадулин, Т.Г. Ермолкевич, И.Л. Гольдман, Е.Р. Садчикова. Исследование рекомбинантного лактоферрина человека, секретируемого в молоко трансгенных мышей. ДАН, 2006, т.411, 2, стр. 1-3.).

Первые результаты биохимических исследований лактоферрина человека исследований оказались следующими.

Аминокислотная последовательность лактоферрина человека имела длину 690 аминокислот:

RRR SVQ WCA VSQ PEA TKC FQW QRN MRK VRG PPV SCI KRD SPI QCI QAI AEN RAD AVT LDG GFI YEA GLA PYK LRP VAA EVY GTE RQP RTH YYA VAV VKK GGS FQL NEL QGL KSC HTG LRR TAG WNV PIG TLR PFL NWT GPP EPI EAA VAR FFS ASC VPG ADK GQF PNL CRL CAG TGE NKC AFS SQE PYF SYS GAF KCL RDG AGD VAF IRE STV FED LSD EAE RDE YEL LCP DNT RKP VDK FKD CHL ARV PSH AVV ARS VNG KED AIW NLL RQA QEK FGK DKS PKF QLF GSP SGQ KDL LFK DSA IGF SRV PPR IDS GLY LGS GYF TAI QNL RKS EEE VAA RRA RVV WCA VGE QEL RKC NQW SGL SEG SVT CSS AST TED CIA LVL KGE ADA MSL DGG YVY TAG KCG LVP VLA ENY KSQ QSS DPD PNC VDR PVE GYL AVA VVR RSD TSL TWN SVK GKK SCH TAV DRT AGW NIP MGL LFN QTG SCK FDE YFS QSC APG SDP RSN LCA LCI GDE QGE NKC VPN SNE RYY GYT GAF RCL AEN AGD VAF VKD VTV LQN TDG NNN EAW AKD LKL ADF ALL CLD GKR KPV TEA RSC HLA MAP NHA VVS RMD KVE RLK QVL LHQ QAK FGR NGS DCP DKF CLF QSE TKN LLF NDN TEC LAR LHG KTT YEK YLG PQY VAG ITN LKK CST SPL LEA CEF LRK

Это наиболее распространенная в популяции форма, вне зависимости от того, в организме какого вида происходит его экспрессия.

Данной последовательности соответствовала молекулярная масса 76 кD. Однако, поскольку лактоферрин человека содержит по крайней мере 2 участка гликозилирования (подчеркнуто), то реальная молекулярная масса этого белка оказывается выше и составляет 78-80 kD. Участки гликозилирования универсальны для всех эукариотических систем экспрессии, хотя химический состав и порядок присоединения гликозидов может несколько различаться, особенно у эволюционно далеких видов.

Природное свойство лактоферрина связывать ионы Fe3+ с константой, превышающей 1020 - нередко приводит к продукции лактоферрина в организме в уже насыщенной железом форме.
Это обычно происходит у человека и крупных с\х животных на поздних стадиях лактации.

Лактоферрин из организма человека, собранный на ранних стадиях лактации или выделенный из иных, чем молоко физиологических жидкостей, насыщен железом менее чем на 5%.

Лактоферрин из молока мышей, трансгенных по лактоферрин человека насыщен железом от 20 до 50%.

Лактоферрин из молока коз - продуцентов насыщен железом менее чем на 10% (от 5 до 10% на сегодняшний день).

Fe3+ высвобождается из лактоферрина легким рН шоком в присутствии хелатирующих агентов без необратимой денатурации белка.


Лактоферрин человека из молока трансгенных мышей легко отделяется от эндогенных белков благодаря высокому положительному заряду. Уровень продукции трансгенного лактоферрина составляет в среднем несколько десятков мг/мл.

Лактоферрин человека из молока трансгенных коз легко отделяется от эндогенных белков, кроме эндогенного лактоферрина, т.е. в случае коз мы работаем фактически со смесью двух лактоферринов.
Лактоферрин козы присутствует в молоке козы в среднем в концентрации 0.1 мг/мл. Уровень продукции трансгенного лактоферрин составляет несколько мг/мл.

Разделение двух лактоферринов требует или высокоэффективной ионообменной хроматографии или аффинных методов.

Требовалось оценить состояние здоровья трансгенных животных-продуцентов. К настоящему времени нам удалось выполнить исследование здоровья трансгенных мышей и определить состояние здоровья линий мышей-продуцентов. Линии получены размножением первичных трансгенных животных, передающих трансген с высоким уровнем продукции этого белка с молоком. Было показано, что линии трансгенных мышей характеризовались нормальной воспроизводительной способностью, соответствующей физиологической норме для данного вида животных и сохранением этих показателей в ряду поколений, включая уровень продукции лактоферрина человека в молоке (А.В. Дейкин, Т.Г. Ермолкевич, И.Л. Гольдман, Я.Г. Гурский, А.Н. Краснов, А.Н. Попов, С.Г. Георгиева, С.Л.Кузнецов, В.Г. Деревянко, Н.И. Новикова, А.Н. Мурашев, Е.Р. Садчикова. Состояние здоровья и воспроизводительная способность трансгенных мышей, продуцирующих с молоком рекомбинантный белок человека лактоферрин. ДАН. 2009;427(4),545-548).

Для рекомбинантного лактоферрина человека, выделенного из молока наших трансгенных мышей и коз показаны выраженные бактерицидные свойства. (A. Chernousov, I. Goldman, E. Sadchikova. Аpplication Potential of Recombinant Human Lactoferrin in Antibiotic-Resistant Infection Control, Recent Advances in Clinical Medicine, 2010).

В настоящее время широкое распространение получил лактоферрин, выделенный из молозива и молока коров. Содержание его там крайне мало, что требует переработки большого количества молока. Лактоферрин крупного рогатого скота широко используется как биологическая добавка для изготовления функционального питания. Количество биологически активных добавок с лактоферрином крупного рогатого скота, выпускаемых в мире превысило сотню наименований. Некоторые из них разрешены к использованию в РФ Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, и вошли в Реестр продукции, прошедшей государственную регистрацию.

Исследование лактоферрина человека, полученного из молока коз, выполняется нами по широкой программе, с участием большого круга организаций и научно-исследовательских институтов медицинского профиля.



  Яндекс цитирования     PCR-RUS         АгроПоиск - аграрная поисковая система

© 2004-2015 "ТРАНСГЕНФАРМ"

Дата последней модификации страницы:    Thursday, 13-Jan-2011 00:00:28 MSK