ТРАНСГЕНФАРМ
Биотехнологический центр трансгенеза
в фарминдустрии


("ТРАНСГЕНФАРМ")
ТРАНСГЕНФАРМ

Наши достижения



ЭТАПЫ РАЗВИТИЯ ПРОГРАММ СОЮЗНОГО ГОСУДАРСТВА «БЕЛРОСТРАНСГЕН» И «БЕЛРОСТРАНСГЕН-2»

goat

В Институте биологии гена РАН в рамках Программы Союзного государства "Создание высокоэффективных и биологически безопасных лекарственных препаратов нового поколения на основе белков человека, получаемых из молока трансгенных животных" ("БелРосТрансген"), создана панель генных конструкций, содержащих ген лактоферрина человека. Пять конструкций обеспечивали экспрессию белка лактоферрина человека с молоком трансгенных мышей, Рис. 1.

Работа с трансгенами

Рис.1. Структура экспрессионных конструкций с геном лактоферрина человека.

Две копии инсулятора отмечены крестами, серым цветом выделен бета-казеиновый промотор, черными прямоугольниками отмечены кодирующие области лактоферрина, белыми прямоугольниками отмечены нетранслируемые области.

hLf2 – По сайту XhoI в вектор pBC1 клонирована кДНК лактоферрина размером 2100 п.н.
hLf3 – По сайту XhoI в вектор pBC1 клонирована гибридная конструкция лактоферрина. Первая часть – геномная копия с 1 по 7 экзон (14479bp, с ATG кодона до SmaI сайта), вторая часть – кДНК (1331bp, от SmaI сайта до Stop кодона). Эти две части состыкованы по SmaI сайту, который находится в 7 экзоне.
hLf5 – По сайтам XhoI-NotI в вектор pBC1 клонирована геномная последовательность лактоферрина длиной 35013 bp, начиная с ATG кодона.
hLf7 – По сайту XhoI в вектор pBC1 клонирована геномная последовательность лактоферрина длиной 28672 bp, начиная с ATG кодона.
hLf8 – Из конструкции hLf7 удалены инсуляторы перед бета-казеиновым промотором.


Уровень экспрессии лактоферрина человека в молоке трансгенных мышей варьировал в зависимости от использованной генной конструкции и у индивидуальных животных, Таблица 1

Табл. 1. Содержание лактоферрина человека в молоке 18-и первичных трансгенных самок мышей, продуцирующих этот белок


Генная конструкция

первичных трансгенных мышей

Продукция лактоферрина человека с молоком, г/л

hLf2

221

4,00

hLf3

277

6,10

1118

8,70

385

14,00

263

10,20

230

0,87

hLf5

112

1,50

115

4,80

116

33,00

146

40,00

hLf7

705

4,20

787

5,60

790

8,09

793

3,70

809

7,40

hLf8

1252

3,30

1238

0,22

1174

1,50


Продукция лактоферрина человека в молоке трансгенных животных была тканеспецифичной. Следовые количества лактоферрина человека обнаруживались в мозгу и мышечной ткани животных, Таблица 2.

Табл. 2. Результаты анализа экспрессии трансгена.
(за 1 принят уровень экспрессии в мышце)


 LTF5  Молочная железа  447
 печень  0,0
 селезёнка  0,1
 яичники  0,5
 почки  0,1
 подж. железа  0,0
 сердце  0,5
 лёгкие  0,1
 тимус  0,0
 головной мозг  0,0
 
 LTF10  молочная железа  7,4
 мышцы  1
 
 LTF11  молочная железа  6,1
 мышцы  1


При размножении первичных трансгенных самок, отличающихся высоким уровнем экспрессии с молоком лактоферрина человека, получены линии трансгенных мышей со средней продукцией лактоферрина человека 10-15 г/л.

Показана возможность создания популяции трансгенных мышей, характеризующихся высоким уровнем экспрессии лактоферрина человека с молоком при использовании первичных трансгенных самцов, Таблица 3.

Табл. 3. Уровень продукции лактоферрина человека с молоком дочерей первичных трансгенных самцов.



Конструкция

№ самца

№ дочери

hLTF в молоке, г/л

Среднее

hLf3

281

285

12,3

14,6

295

12,6

395

14,6

1152

16,0

293

16,3

1150

18,1

294

20,7

1304

5,8

hLf3

373

718

8,7

11,6

609

20,2

1212

6,0

hLf3

382

2436

12,4

12,4

hLf3

398

1216

10,4

10,4

hLf3

1112

148

3,7

6,6

2633

7,1

2599

4,7

151

8,3

2633

7,8

149

9,9

2629

4,8

Среднее по конструкции 11,0

hLf5

113

121

13,0

23,4

164

16,4

127

32,4

185

22,3

175

33,0

hLf5

138

636

10,0

12,4

641

11,2

631

12,0

633

14,0

634

15,0

hLf5

145

 

49

15,7

 

 

672

4,9

678

20,3

684

24,0

Среднее по конструкции 17,4

Среднее по всем конструкциям 13,7

 

Н ам удалось создать линии трансгенных мышей, у которых продукция лактоферрина человека с молоком максимально достигала 160 г/л.

В биотехнологическом центре белорусского города Жодино в совместных экспериментах российских (Институт Биологии Гена РАН) и белорусских учёных(Научно-практический центр НАН Беларуси по животноводству) осенью 2007 г. впервые получены козлята, трансгенные по гену лактоферрина человека.

ТРАНСГЕНФАРМ

Рис. 2. Козлята зааненской породы (Лак-1 и Лак-2),
трансгенные по гену лактоферрина человека.



Проверка наличия трансгена лактоферрина в геноме коз.


Были проанализированы образцы ДНК, выделенные из кожи ушей и крови козлов. Анализ показал, что козлы с номерами 7366, 7390 содержат трансген. Трансген содержится как в ДНК, выделенной из ушей, так и в ДНК, выделенной из крови животных.
Анализ был проведен с помощью ПЦР в режиме реального времени с использованием праймеров 5'-gga acg gag tca gtg agg atg g, 5'-cag gaa gca ggt agg gtg gtc. Наличие ПЦР продукта в исследуемом образце означает наличие трансгенной ДНК, так как первый праймер расположен в инсуляторе из генома кур, второй праймер в промоторе казеинового гена коз. Данная комбинация праймеров присутствует только в трансгенной конструкции и отсутствует в геноме человека и коз (что было продемонстрировано в негативных контролях).
Для дополнительного контроля были показано, что трансгенные козы содержат также три других фрагмента геномной конструкции, из первого интрона, из второго интрона, и стык шестого интрона и седьмого экзона.

goat lactoferrin men


На Рисунке 3 виден, положительный результат у двух трансгенных образцов, у которых пороговый цикл около 25. Результаты ПЦР реакции были также нанесены на форез и показано, что ПЦР реакция из трансгенных образцов содержит ПЦР фрагмент требуемой длины - 118bp. В нетрансгенных образцах ПЦР фрагментов нет.

В возрасте 8- и месяцев, в результате пробной садки, были получены первые порции спермы козлов Лак-1 и Лак-2, которые исследовались на трансгенность.

goat lactoferrin men трансгенная сперма козлов с геном лактоферрина человека

Рис.4. Проверка наличия гена лактоферрина человека в сперме козлов.
K- - нетрансгенные козлы
K+ - человеческая ДНК
Tr 1,2 - козлы, трансгены. Копийность одинакова между козлами.

Рождение трансгенного потомства

В 2009 году на биотехнологических фермах в Республике Беларусь и Российской Федерации от первичных, трансгенных по гену лактоферрина человека козлов Лак-1 и Лак-2, родились потомки.

Работа с трансгенами

Рис.5. Первое трансгенное потомство Лак-1 и Лак-2.



goat lactoferrin men трансгенная ДНК потомков козлов с геном лактоферрина человека

Рис.6. Проверка наличия гена лактоферрина человека в ДНК потомков трансгенных козлов.
K- - нетрансгенные козлы
K+ - человеческая ДНК
Tr - козлики и козочки, трансгены.

Продукция лактоферрина человека

В России и Беларуси создано экспериментальное стадо коз - продуцентов лактоферрина человека. Дочери трансгенного козла ЛАК-1 продуцируют в среднем 5,0 г/л лактоферрина человека. Дочери трансгенного козла ЛАК-2 продуцируют в среднем 2,0 г/л лактоферрина человека.


Интеллектуальная собственность.

Интеллектуальное право на результаты фундаментальных исследований по проблеме использования трансгенных животных в качестве биореакторов для получения с молоком лактоферрина человека, принадлежат ИБГ РАН. К патентованию предполагаются оригинальные генные конструкции с геном лактоферрина человека. Технологические разработки и трансгенные по гену лактоферрина человека животные-продуценты будут патентоваться в рамках имеющихся соглашений с белорусской стороной, принимающей участие в реализации проекта Союзного государства "БелРосТрансген".


Резюме

В Институте биологии гена Российской академии наук создана уникальная популяция трансгенных мышей, несущих в геноме ген бактерицидного белка женского грудного молока лактоферрина. На этих животных, полученных с использованием различных генных конструкций, показана возможность достижения высокого уровня экспрессии лактоферрина человека с молоком трансгенных животных в ряду поколений при размножении первичных трансгенов, отличающихся высоким уровнем экспрессии лактоферрина человека.
Эта работа направлена на решение фундаментальной проблемы - экспрессии генов, которая является ключевой для широкого круга практических направлений использования генетически модифицированных животных. Были проведены популяционные исследования, которые, как мы полагаем, ответили на некоторые вопросы, касающиеся выбора трансгенных животных - производителей, которые должны стать родоначальниками промышленных стад животных - продуцентов с молоком лактоферрина человека.
Предложена технология использования первичных трансгенных самцов, которая позволит создавать стада трансгенных животных-производителей лекарственных белков человека с сохранением экономически значимой продукции белка интереса в ряду поколений.


  Яндекс цитирования     PCR-RUS         АгроПоиск - аграрная поисковая система

© 2004-2015 "ТРАНСГЕНФАРМ"

Дата последней модификации страницы:    Friday, 18-Mar-2011 14:00:49 MSK